（3）除蛋白质中离心时间的乳酸乳球优化

本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的菌胞究三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g的外多离心力下分别离心10min、20min、糖提30min、取纯40min，化工选取最优化离心时间，艺研如图4所示。乳酸乳球离心的菌胞究时间选取30～40min为最佳。

3、外多乙醇沉淀多糖条件的糖提优化

（1）乙醇沉淀多糖中乙醇浓度的优化

本实验中发酵液细胞分离后，加入50%的取纯三氯乙酸溶液1/5体积，在16000×g的化工离心力下分别离心40min，加入3倍体积浓度分别为70%、艺研80%、乳酸乳球95%、100%的乙醇溶液，4℃条件下醇沉12h。透析，测定胞外多糖的产量，如图5所示。多糖的提取量随着乙醇浓度的增加而不断增大。一些小分子的多糖分子在低浓度的乙醇下不易沉淀，只有当乙醇浓度足够高时，才发生沉淀。因此当乙醇浓度为100%时，达到最大值，即乙醇沉淀多糖的最优浓度为100%。

（2）乙醇沉淀多糖中乙醇体积的优化

蛋白沉淀后分别按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的料醇比加入浓度为100%的乙醇溶液，测定胞外多糖的产量，如图6所示。增加乙醇添加体积可以提高胞外多糖的获得量，沉淀中多糖提取率随乙醇添加倍数的增加而升高，但是当乙醇添加倍数在3～4倍时，EPS含量明显提高，且都达到较高浓度，所以从提取成本考虑，最佳的乙醇添加倍数为3倍。

（3）乙醇沉淀多糖中沉淀时间的优化

乙醇沉淀多糖中在4℃条件下分别醇沉12h、24h、36h，测定胞外多糖的产量，如图7所示。醇沉时间与胞外多糖含量的关系不明显。而实验过程中，加入乙醇后立即产生沉淀，并且随着醇沉时间的增加，沉淀物颜色不断加深。为了保证粗多糖的纯度，醇沉时间选12h最宜。

4、正交实验分析

分别选取影响EPS含量较大的提取条件，三氯乙酸浓度、离心力和离心时间进行三因素三水平正交实验，结果如表1。结果表明，影响EPS含量的各因素主次关系为B＞C＞A，离心力对多糖提取的影响较大，离心时间次之，三氯乙酸浓度对多糖提取的影响最小。根据正交实验结果，得出最优发酵条件组合为A₃B₂C₃，即60%的三氯乙酸浓度、在14000×g的离心力下离心40min。研究表明，离心力和离心时间的增加可以提高蛋白的脱离率，但会减少最终EPS含量，降低多糖提纯得率，因此，在14000×g离心力下离心40min最佳，EPS含量可达到392.50mg/L。

三、结论

本项目以筛选出的胞外多糖高产菌乳酸乳球菌乳亚种LL9为菌种，进行EPS提取纯化工艺条件研究。使用三氯乙酸法沉淀蛋白质，通过适当控制三氯乙酸的用量来降低对EPS结构的破坏。通过单因素实验及正交实验最终验证，发现当用浓度为60%三氯乙酸处理过发酵液后，在14000×g离心力下离心40min除蛋白效果最佳；沉淀多糖的最优组合是3倍体积、浓度为100%的乙醇沉淀12h。最优化分离纯化工艺条件为：添加三氯乙酸60%（w/v）（12h）→500r/min搅拌5min→离心沉淀除蛋白（4℃，14000×g，40min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍体积，4℃，处理12h）→离心（12000×g，30min）→冷冻干燥→沉淀温水溶解（稀释10倍）→透析MD34（4℃，处理12h）。经实验验证工艺流程合理并可行。EPS含量最后达到392.50mg/L，产量为原来的1.49倍。为今后进一步纯化和深入研究乳酸菌产胞外多糖的结构和生物活性等提供参考。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：三氯乙酸，乳酸乳球菌，乙醇

• ·2024年宿州市进出口总值65.6亿元
• ·值得买科技亮相服贸会 帮助消费者提高决策效率
• ·48起官司背后的“网购乱象”
• ·宝岛眼镜发布虚假广告被罚 律师表示消费者可依法三倍索赔
• ·剑与远征驭星猎手背景故事与角色技能深度解析
• ·藏得深、坐席忙、打不通 福建省消委会测评68条客户服务热线人工服务
• ·30万互助金变为1.1万元 网络互助产品如何定性？
• ·市场监管总局加大行政指导力度 切实维护共享消费领域价格竞争秩序
• ·宿州火车站：多措并举确保旅客安全出行
• ·防汛救灾 坚守一线 河南市场监管部门在行动
• ·不退款只返币引发万余条投诉 知乎、B站、小红书等涉嫌强制消费
• ·奋斗百年路 启航新征程•劳动创造幸福
• ·不可忽视的沙门氏菌：夏秋季为感染高峰期，儿童感染占比较高
• ·2021年福州市民质量满意度稳步提升
• ·浙江省宁波市首批化妆品不良反应监测哨点医院挂牌
• ·花20万元买盲盒亏了15万 警惕盲盒消费堕入网络赌博深渊